在生命科學與醫(yī)學研究領(lǐng)域，精確檢測生物分子的含量和活性是探索生命奧秘、攻克疾病難題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的酶標儀作為一種能夠快速、高效測定微孔板中吸光度或熒光強度的儀器，在眾多科研實驗中發(fā)揮著不可或缺的作用。本實驗以檢測血清中某腫瘤標志物含量為例，詳細介紹酶標儀在科研實驗中的具體應用過程。

一、實驗目的

利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)結(jié)合酶標儀，準確測定不同患者血清樣本中腫瘤標志物甲胎蛋白（AFP）的含量，通過分析其含量差異，為腫瘤的早期診斷、病情監(jiān)測及預后評估提供數(shù)據(jù)支持，并驗證酶標儀在該類檢測實驗中的準確性和可靠性。

二、實驗設計

（一） 實驗材料

1、樣本：收集30份臨床患者血清樣本，其中包括10份確診肝癌患者血清10份肝硬化患者血清以及10份健康人血清，所有樣本均經(jīng)過倫理審查并獲得患者知情同意，采集后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

2、試劑：AFP ELISA檢測試劑盒（包含預包被AFP抗體的微孔板、AFP標準品、生物素標記的檢測抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素、底物顯色液、終止液、洗滌緩沖液等）、磷酸鹽緩沖液（PBS）。

3、儀器：酶標儀（具備450nm波長檢測功能）、恒溫培養(yǎng)箱、微量移液器及配套吸頭、振蕩器、離心機。

（二）樣本分組與處理

將30份血清樣本按照疾病類型分為肝癌組、肝硬化組和健康對照組，每組10個樣本。實驗前將血清樣本從-80℃冰箱取出，置于室溫下緩慢解凍，輕輕顛倒混勻后，以3000rpm離心10分鐘，取上清液用于后續(xù)檢測，避免樣本中雜質(zhì)影響檢測結(jié)果。

三、實驗操作步驟

（一） 準備工作

1、從冰箱中取出AFP ELISA 檢測試劑盒，平衡至室溫（約30分鐘），同時將洗滌緩沖液用蒸餾水按1:20比例稀釋備用。

2、根據(jù)實驗需求，將所需的微孔板條放入微孔板框架中，剩余的板條密封后放回試劑盒中，置于4℃保存。

（二） 加樣

1、標準品稀釋：在1.5ml離心管中，將AFP標準品按照試劑盒說明書進行倍比稀釋，制備濃度依次為0ng/mL（空白對照）、5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、625ng/mL、3125ng/mL的標準品溶液。

2、加樣：分別取50μl不同濃度的標準品溶液加入對應的微孔中，每個濃度設置3個復孔；然后取50μl血清樣本加入相應的微孔，同樣每個樣本設置3個復孔。加樣時，移液器吸頭應垂直懸空于微孔上方，避免吸頭觸碰孔壁，防止樣本交叉污染。

（三） 溫育與洗滌

1、加樣完成后，在每孔中加入50μl生物素標記的檢測抗體，輕輕振蕩微孔板使溶液混合均勻，用封板膜密封微孔板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育60分鐘，使抗體與抗原充分結(jié)合。

2、溫育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入350μl洗滌緩沖液，靜置30秒后甩干，重復洗滌5次，以徹底去除未結(jié)合的物質(zhì)，減少背景干擾。洗滌過程中，可使用振蕩器輔助，確保洗滌充分。

（四） 顯色與終止反應

1、每孔加入100μlHRP標記的鏈霉親和素，輕輕振蕩混勻，再次用封板膜密封，37℃溫育30分鐘。

2、溫育結(jié)束后，重復上述洗滌步驟5次。

3、每孔加入100μl底物顯色液，輕輕振蕩后，室溫避光顯色15-20分鐘，觀察到標準品孔出現(xiàn)明顯顏色變化。

4、每孔加入50μl終止液，終止顯色反應，此時溶液顏色由藍色變?yōu)辄S色。

（五）酶標儀檢測

將微孔板放入酶標儀中，設置檢測波長為450nm，測定各孔的吸光度（OD值）。在檢測前，確保酶標儀預熱至穩(wěn)定狀態(tài)，并按照儀器操作手冊進行校準，以保證檢測結(jié)果的準確性。

四、實驗結(jié)果分析

（一）原始數(shù)據(jù)整理

記錄酶標儀檢測得到的各標準品孔和樣本孔的OD值，剔除明顯異常的OD值（如因加樣失誤、孔內(nèi)有氣泡等導致的數(shù)據(jù)），計算每個標準品濃度和樣本的OD值平均值。

（二）標準曲線繪制

以AFP標準品濃度為橫坐標，對應的OD值平均值為縱坐標，使用GraphPad Prism或Excel軟件繪制標準曲線。選擇合適的曲線擬合方式（如四參數(shù)邏輯回歸模型），得到標準曲線的回歸方程，確保標準曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.99，以保證曲線的可靠性。

（三）樣本濃度計算

將樣本的OD值平均值代入標準曲線回歸方程，計算出各血清樣本中AFP的濃度。同時，計算每組樣本（肝癌組、肝硬化組、健康對照組）AFP濃度的平均值、標準差和置信區(qū)間。

（四）統(tǒng)計學分析

采用單因素方差分析（One-way ANOVA）比較三組樣本AFP濃度的差異，若差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），進一步使用Tukey多重比較法進行組間兩兩比較，明確不同組之間的具體差異。

（五） 結(jié)果呈現(xiàn)

1、以表格形式展示各標準品濃度、對應的OD值平均值以及樣本的AFP濃度計算結(jié)果。

2、繪制柱狀圖直觀呈現(xiàn)三組樣本AFP濃度的平均值和標準差，清晰展示不同組之間AFP含量的差異。

3、結(jié)合統(tǒng)計學分析結(jié)果，撰寫結(jié)果分析報告，闡述實驗數(shù)據(jù)所反映的生物學意義，如肝癌患者血清中AFP濃度顯著高于肝硬化患者和健康人，驗證AFP作為腫瘤標志物在肝癌診斷中的應用價值。

五、實驗結(jié)論

本實驗成功運用酶標儀結(jié)合ELISA技術(shù)完成了血清中腫瘤標志物AFP含量的檢測。實驗結(jié)果表明，博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)生產(chǎn)的酶標儀能夠準確測定微孔板中樣本的吸光度，通過標準曲線計算得到的樣本AFP濃度具有較高的可靠性。不同疾病組患者血清中AFP含量存在顯著差異，與臨床認知相符，進一步驗證了AFP在腫瘤診斷中的重要作用。同時，本實驗的操作流程和數(shù)據(jù)分析方法為其他基于酶標儀的免疫檢測實驗提供了參考范例，有助于推動相關(guān)科研和臨床檢測工作的開展。在未來的研究中，可進一步擴大樣本量，深入探究AFP含量與腫瘤分期、預后等因素的關(guān)系，為腫瘤的精準診療提供更豐富的依據(jù)。